In Silico Screening of NRas Protein Oncogenic Mutations: New Structural and Physico-Chemical Insights into the Catalytic Activity
Criblage In silico des mutations oncogéniques de la protéine NRas: Nouvelles données structurelles et physico-chimiques de l'activité catalytique
Résumé
By controlling cellular signal transduction pathways, Ras proteins play a key role in cell differentiation, proliferation and survival. In the GTP-bound conformation, they interact with downstream effector molecules ensuring multiple tasks within the cell. The hydrolysis reaction of GTP into GDP that is catalyzed in their center, is accompanied by a conformational change, leading to an inactive state.
Specific Ras mutations cause a hydrolysis rate drop that leaves Ras in a GTP-bound, continuously active, state. Now, these mutated hyperactive forms of Ras have been associated with abnormal cell proliferation, emblematic of cancerous tissues dissemination. Therefore, the elucidation of Ras catalyzing mechanisms for accelerating GTP hydrolysis constitutes a major step in the development of cancer targeted therapies. In this sense, we attempted to understand such mechanisms and propose a new strategy to restore, within oncogenic mutants, a hydrolysis rate close to that of the wild-type protein. This study is focused on NRas isoform that is mutated in 25% of malignant melanomas.
In order to get insight at the atomic level on Ras catalyzing properties, molecular dynamics simulations were carried out, describing wild-type and mutant NRas active site at different levels of theory (Molecular Mechanics, Semi-empirical and Density Functional Theory). These calculations first show that water molecules positioning in the active site is crucial for an efficient catalysis of the reaction. Indeed, the precise solvent distribution observed within the wild-type is lost within the mutated forms of NRas considered here. This difference, as well as the active site structural modifications induced by Gln 61 substitutions, have a direct impact on GTP electronic density that is accommodated to a GDP-like state within the wild-type protein only. To end, an alternative reaction pathway of the enzymatic hydrolysis of GTP is proposed.
Besides, these calculations were coupled to biomechanical characterizations, employing the Static Modes approach. They lead to the identification of residues of interest that have a mechanical influence on Ras GTPase function. Subsequently, mutations were introduced on these sites to identify an additional mutation that would annihilate the effects of the primary oncogenic mutations. The characterization of the doubly mutated proteins shows that one of them restores water distribution so that it is similar to that observed within wild-type NRas. Moreover, this function recovery engineered protein has been validated in cellulo by an experimental team. This result should make it possible to propose new drug molecules that mimick the effects of the second mutation and thereby restore GTP hydrolysis within oncogenic NRas.
En contrôlant la transduction du signal cellulaire, les protéines Ras jouent un rôle majeur dans la différenciation, la prolifération et la survie des cellules. Liées au GTP, elles adoptent une conformation active leur permettant d'interagir avec des effecteurs en aval. La réaction d'hydrolyse du GTP en GDP qu’elles catalysent en leur centre, est accompagnée d’un changement de conformation menant à un état inactif.
Des mutations spécifiques de Ras entraînent une baisse du taux d'hydrolyse, la laissant liée au GTP et donc continuellement active. Or, ces formes mutées hyperactives de Ras ont été associées à une prolifération cellulaire anormale, caractéristique de la dissémination de tissus cancéreux. L’élucidation des mécanismes employés par Ras pour catalyser l’hydrolyse du GTP constitue donc une étape majeure dans le développement de thérapies ciblées contre le cancer. Dans ce sens, nous avons cherché à comprendre ces mécanismes et à proposer une nouvelle stratégie pour rétablir, au sein des mutants oncogéniques, un taux d’hydrolyse proche de celui des Ras de type sauvage. Cette étude est focalisée sur l’isoforme NRas, mutée dans 25% des mélanomes malins.
Dans le but de mieux comprendre au niveau atomique les propriétés catalytiques de cette protéine, nous avons mené des simulations de dynamique moléculaire en décrivant le site actif des formes sauvage et mutées de NRas à différents niveaux de théorie (Mécanique Moléculaire, Semi-empirique et Théorie de la Fonctionnelle de la Densité). Ces calculs ont tout d’abord montré que le positionnement des molécules d'eau dans le site actif est crucial pour catalyser efficacement la réaction. En effet, la distribution précise du solvant observée dans le type sauvage, est perdue au sein des mutants de NRas considérés ici. Cette différence, ainsi que les modifications structurales du site actif engendrées par les substitutions du résidu 61, ont un impact direct sur la densité électronique du GTP qui perd alors le profil de type GDP observé au sein de la protéine de type sauvage uniquement. Pour terminer, un chemin réactionnel alternati! f de l'hydrolyse du GTP est proposé.
Ces calculs ont par ailleurs été couplés à des caractérisations biomécaniques en utilisant la méthode des Modes Statiques. Des résidus d’intérêt ayant une influence sur la fonction GTPase ont ainsi été identifiés. Ils ont ensuite été mutés afin de trouver une mutation supplémentaire pouvant annihiler les effets des mutations oncogéniques présentes initialement. La caractérisation des doubles mutants ainsi générés montre qu’une des modifications du site identifié permettent de rétablir une distribution de l’eau semblable à celle observée dans NRas de type sauvage. De plus, le double mutant en question a été validé in cellulo par une équipe expérimentale. Ce résultat devrait permettre de proposer de nouvelles molécules médicamenteuses mimant les effets de la mutation générée et restaurant ainsi l'hydrolyse du GTP au sein des mutants oncogéniques de NRas.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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