Automation of AFM measurements for biological applications
Automatisation des mesures AFM pour des applications en biologie
Résumé
In recent years mechanical phenotype of cells (such as adhesion, elasticity, stiffness), also known as mechanical properties, has been proved to be a valid identifier to distinguish healthy cells from diseased cells. Researchers around the world have related the mechanical phenotype to cancer, cardiovascular, and blood-related diseases, among others. Atomic force microscopy (AFM) is the most used technique to measure mechanical properties, and it makes it possible to obtain the properties at the nanoscale. However, AFM manipulation requires high technical skills, and initially, it was not designed for biological samples. However, the capability to analyze samples in air or liquid in recent years makes it more appealing for the living area. However, using the current AFMs, it is not straightfoward to analyze a high number of cells or cell population and then it is difficult to obtain statistical results. This doctoral thesis aims at solving the problem of low throughput, an automated methodology is proposed to do it. This methodology is based on the combination of two techniques, cell arrays, and AFM automation. The mechanical measurements are done automatically by executing a developed Jython script, and the cells are immobilized in known positions proposing here a number a number of conducted measurements compared with was found in the literature. Firstly, Immobilization is done for the microbes in microfabricated PDMS stamps and the mammalian cells in commercial cell arrays (BIOSOFT and CYTOO). The immobilization is done, in the case of the microbes, using convective/capillary assembly technique reaching ~85 % filling rate. And for the mammalian cells, the technique used attached the cell to a surface previously functionalized. Next, the AFM was modified to perform the measurements automatically. The automation was made by developing a Jython written script and executed directly in a commercial BioAFM (JPK Germany). The script is versatile, and it has been adapted, or it can be adapted to several sample configurations. The script performs a small number of indentations (9 or 16) on the sample, acquiring force curves from different regions of the cells and at the same time, reducing the time spent on each cell. The results demonstrated that increasing the number of cells impacts the number of measurements done to the cells, and it is still possible to obtain results comparable to the results reported in the literature. For the first time, the stiffness analysis on ~900 yeast cells (C. albicans) is reported, and it is evident the presence of two subpopulations. We compared native yeast cells with caspofungin treated yeast cells. The results were obtained in 4 h with 9 indentations per cell. For the HeLa cells, the comparison was made between native HeLa cells and fixed HeLa cells; and ~80 cells were analyzed in 30 minutes. In both cases (mammalian and yeast cells), a shift between the native and treated cells was observed, this shift agrees with the literature and proves that is possible to reduce the number of indentations done to the cells if the number of analyzed cells is high. Thanks to the massive amount of data collected, it was possible to use Machine learning, and the preliminary results show that it is possible to distinguish between native and treated cells. The differentiation was made entering the descriptors: stiffness, adhesion, and work of adhesion to the machine learning algorithm. This work contributes to achieving a statistical significance, which is one of the main drawbacks of AFM mechanical analysis and can be considered as one of the first steps to have a diagnostic tool from the atomic force microscope.
Ces dernières années, le phénotype mécanique des cellules (tel que l'adhésion, l'élasticité, la rigidité), également connu sous le nom de propriétés mécaniques, s'est avéré être un identifiant valable pour distinguer les cellules saines des cellules malades. Les chercheurs du monde entier ont établi un phénotype mécanique lié au cancer, aux maladies cardiovasculaires et aux maladies du sang, entre autres. La microscopie à force atomique (AFM) est la technique la plus utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques et permet d'obtenir les propriétés à l'échelle nanométrique. Cependant, la manipulation de l'AFM requiert des compétences techniques élevées et n'a pas été conçue pour les échantillons biologiques. Cependant, la possibilité d'analyser des échantillons dans l'air ou dans un liquide ces dernières années la rend plus attrayante pour le domaine du vivant. Cependant, avec les AFM actuels, il n'est pas évident d'analyser un nombre élevé de cellules ou de population cellulaire et il est ensuite difficile d'obtenir des résultats statistiques. Cette thèse de doctorat vise à résoudre le problème du faible débit, une méthodologie automatisée est proposée pour y parvenir. Cette méthodologie est basée sur la combinaison de deux techniques : des réseaux de cellules et l'automatisation de l'AFM. Les mesures mécaniques sont effectuées automatiquement en exécutant un script développé en Jython et les cellules sont immobilisées dans des positions connues permettant ainsi un plus grand nombre de mesures par rapport à ce qui a été démontré jusqu'ici dans la littérature. Premièrement, l'immobilisation est effectuée pour les microbes dans des timbres PDMS microfabriqués et les cellules de mammifères dans des réseaux de cellules commerciales (BIOSOFT et CYTOO). L'immobilisation est effectuée, dans le cas des microbes, en utilisant une technique d'assemblage convectif/capillaire atteignant un taux de remplissage d'environ 85 %. Et pour les cellules de mammifères, la technique utilisée consiste à fixer la cellule sur une surface préalablement fonctionnalisée. Ensuite, l'AFM a été modifié pour effectuer les mesures automatiquement. L'automatisation a été réalisée par le développement d'un script écrit en Jython et exécuté directement dans un BioAFM commercial (JPK Allemagne). Le script est polyvalent et peut être adapté à plusieurs configurations d'échantillons. Le script exécute un petit nombre d'indentations (9 ou 16) sur l'échantillon, en acquérant des courbes de force de différentes régions des cellules et en réduisant en même temps le temps passé sur chaque cellule. Les résultats ont démontré que l'augmentation du nombre de cellules a un impact sur le nombre de mesures effectuées sur les cellules, et il est toujours possible d'obtenir des résultats comparables à ceux rapportés dans la littérature. Pour la première fois, l'analyse de la rigidité sur ~900 cellules de levure (C. albicans) est rapportée et met en évidence la présence de deux sous-populations. Nous avons comparé des cellules de levure natives avec des cellules de levure traitées à la caspofongine. Les résultats ont été obtenus en 4 h avec 9 indentations par cellule. Pour les cellules HeLa, la comparaison a été faite entre les cellules HeLa natives et les cellules HeLa fixées. 80 cellules ont pu être analysées en 30 minutes.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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